L'SMLM risolto temporalmente (con ampio spostamento PAR) ha consentito la visualizzazione della formazione e della migrazione di cluster HA dinamici in una cellula viva

Jul 23, 2023

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 12561 (2023) Citare questo articolo

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Le proprietà di lampeggiamento di una singola molecola sono fondamentali per la microscopia di localizzazione di una singola molecola (SMLM). Tipicamente, le tecniche SMLM prevedono la registrazione di diversi fotogrammi di punti luminosi di singole molecole limitati dalla diffrazione con un tempo di esposizione del rivelatore vicino al periodo di lampeggiamento. Ciò pone un limite alla risoluzione temporale di SMLM a poche decine di millisecondi. Rendendosi conto che una frazione sostanziale di singole molecole emettono fotoni su scale temporali molto più brevi del periodo medio di ammiccamento, proponiamo di accelerare la raccolta dei dati per catturare questi emettitori veloci. Qui, proponiamo un metodo SMLM (shortSMLM) basato su esposizione breve alimentato dal rilevatore sCMOS per comprendere eventi dinamici (sia a livello di singola molecola che di insieme). La tecnica è dimostrata su un modello di malattia influenzale A, in cui le cellule NIH3T3 (sia cellule fisse che vive) sono state trasfettate dal DNA plasmidico Dendra2-HA. L'analisi mostra un miglioramento di 2,76 volte nella risoluzione temporale che comporta un sacrificio nella risoluzione spaziale e uno spostamento PAR della risoluzione delle particelle (in termini di precisione di localizzazione) di \(\sim\) 11,82 nm rispetto allo SMLM standard. Abbiamo visualizzato la formazione dinamica di cluster di HA nelle cellule trasfettate dopo 24 ore di trasfezione del DNA. Si nota che una riduzione della risoluzione spaziale non altera sostanzialmente le caratteristiche dei cluster (densità dei cluster, \(\#\) molecole/cluster, diffusione dei cluster, ecc.) e, anzi, preserva le caratteristiche critiche. Inoltre, l'imaging time-lapse rivela la formazione dinamica e la migrazione dei cluster di emoagglutinina (HA) in una cellula viva. Ciò suggerisce che \(SMLM corto\) utilizzando un rivelatore sCMOS sincronizzato ad alto QE (operato con tempi di esposizione brevi) è eccellente per studiare la dinamica temporale nel sistema cellulare.

Le tecniche standard di microscopia di localizzazione di singola molecola (SMLM) (fPALM1, STORM2, PALM3, IML-SPIM4, MINFLUX5,6, dSTORM7, SOFI8, ROSE9, SMILE10,11, POSSIBLE12 e varianti13,14,15,16,17) in genere acquisiscono diverse migliaia (\(> 10^{3}\) ) immagini di singole molecole per ricostruire una singola immagine super-risolta. Ciò rappresenta un tempo di acquisizione considerevole rispetto ai tempi di esposizione e lettura tipici della fotocamera. Per accelerare la risoluzione temporale complessiva, l'acquisizione dei dati deve essere accelerata. Tuttavia, esiste un limite alla risoluzione temporale dovuto al tempo del ciclo di fluorescenza di una molecola18. In tempi recenti, ci sono stati pochi studi che utilizzano molecole a lampeggiamento rapido, elevata intensità di eccitazione, stati oscuri e fotocamera sCMOS19,20,21,22,23. In altri studi, la riduzione del tempo di acquisizione mediante tecniche computazionali si è rivelata promettente. Altre tecniche che includono l'utilizzo di motori di calcolo veloci (FPGA-GPU e CUDA) abbinati all'intelligenza artificiale hanno mostrato un grande potenziale in SMLM24,25,26,27. Sebbene queste tecniche siano utili, sono soggette a fotosbiancamento. Qui discutiamo dell'acquisizione rapida dei dati basata sulla tecnologia avanzata sCMOS per l'acquisizione di proteine ​​fluorescenti a lampeggiamento rapido (Dendra2). Il comportamento del lampeggiamento di Dendra2 insieme ai tempi ON/OFF è studiato in dettaglio da Avilov et al28. Si prevede che le tecniche di acquisizione rapida insieme ai motori di calcolo veloci costituiscano una combinazione formidabile e abbiano maggiori probabilità di consentire l'imaging a super risoluzione in tempo reale.

Negli ultimi anni si è assistito a un sostanziale progresso in questa direzione e molti gruppi di ricerca hanno affrontato questo problema. Un approccio distinto consiste nell'aumentare il numero di singole molecole attive per fotogramma senza modificare l'intensità e altri parametri sperimentali21,29. Tuttavia, questa tecnica ha un costo in quanto una grande attivazione potrebbe comportare la sovrapposizione delle firme limitate dalla diffrazione di singole molecole, risultando indistinguibili tra le singole molecole e successivamente aumentandone la complessità30. Un recente lavoro di Lin et al. hanno confrontato quantitativamente la qualità dell'immagine per i microtubuli immunomarcati utilizzando Alexa Fluor 647-dye19. Un altro studio di Diekmann et al. ha dimostrato che due fattori critici (vale a dire, la precisione della localizzazione e l'efficienza dell'etichettatura) determinano la qualità dell'immagine SMLM. Hanno studiato sistematicamente le conseguenze della velocità sulla qualità dell'immagine per diversi coloranti (AF647, CF680, CF660C, Dy634) a diverse efficienze e intensità di etichettatura21. A nostra conoscenza, le proteine ​​fotocambiabili come Dendra 2 non sono mai state dimostrate per l'imaging veloce e la microscopia di localizzazione time-lapse e quindi rappresentano un'importante classe di sonde utilizzate nella microscopia a super risoluzione. Nello specifico, le proteine ​​fotocommutabili consentono la clonazione/coniugazione con la proteina di interesse, il che le rende adatte allo studio dei processi biologici (come la progressione della malattia31,32,33) e aiuta a comprendere il meccanismo sottostante.